一 概述
宏基因组是指环境中所有微生物的遗传物质的总和，包括可培养的和不可培养的微生物。它不需要提取微生物培养,可直接获得DNA。这里的环境不只是指土壤、水体等自然环境，还包括人体中的微环境等，如口腔、肠道等。宏基因组学是研究宏基因组的一门新兴学科，是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发 新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。
宏基因组测序与16S测序的主要区别
1、16S长度短，不足以从种水平上区分因为微生物，而宏基因组是尽可能提取了所有微生物的DNA，因此它能获得的信息量较大，可以从鉴定到种；
2、宏基因组是获取微生物基因组的全长序列进行测序，因而能通过组装注释获得基因水平的信息，准确分析每个基因参与哪些代谢通路、调控何种酶的合成、如何变化，16S则无法做到。
宏基因组测序流程
1、提取环境样品中的所有DNA序列；
2、将其打断成300bp、500bp等小片段；
3、在3’端修复和连接A碱基；
4、连接接头构建文库；
5、文库质检；
6、上机测序。
二 样品提取
1、粪便： 不使用抗生素或益生菌； 详细记录各项生活指标和临床指标； 2小时内提取完毕； 置-80oC保存。 2、口腔提取： 唾液、舌苔、牙龈等； 不漱口，不使用抗菌活性的漱口水或牙膏。
三 文库构建
宏基因组文库构建与16S的最大差别在于：
- 16S需要用用引物扩增16S序列中的某些可变区，而在扩增过程中难免会有扩增偏好性，这可能导致有些16S扩增 的次数比正常情况多，有些16S扩增次数少，甚至没有扩增到；
- 宏基因组获取的是全部的DNA，不需要扩增基因组的某个区域，因此不存在扩增偏好性影响后续的分析。
四 上机测序
在测序上，宏基因组测序一般选择illumina Hiseq，它的优点是通量高。因为宏基因组测序量一般在5-10Gb， 可以同时测多个样品，有助于缩短测序时间。通路高还有另一个好处就是能节省成本；宏基因组一般使用pair-end 150bp测序。
五 数据分析
在数据分析上，首先是对原始数据进行质控，接着分两步： 一步是对样品进行物种注释， 进行物种多样性分析； 一步是对样品进行组装，进行基因分析。 宏基因组物种多样性分析方法与16S 类似：先把cleanreads比对到参考序列上，参考序列有多种数据库可选择：
- 直接比对到NCBI的微生物参考基因组；
- 比对到Phylogenetic marker genes；
- 从NCBI的NR库中提起微生物的基因序列做成数据库；
- 使用mOTU数据库，该数据库是从3496个原核生物参考基因组中提取marker genes，再从263个人肠道宏基因组 中识别出marker genes，结合两者构成的一个数据库。
得到物种丰度列表后，接着进行α多样性分析评估，包括稀释曲线、物种累积曲线和多样性指数等。这些都是 为了说明测序的数据量足够覆盖样品中的微生物，增加测序量不会大幅度增加注释到的物种数量。
接着展示各样品中的物种分布以及各样本和所有样品优势物种的分析。
还可以对样品进行物种相似性与差异分析。相似性采用Anosim分析方法。差异分析可采用秩和检验方法， 也可以通过在线的LEfSe和本地是STAMP进行分析。
最后是β多样性分析，分析方法有PCA、PCoA、NMDS、CA等
组装
宏基因组的重头戏是基因组组装
组装原理是根据reads之间重叠的部分将reads连接在一起形成Contig，再根据成对的reads， 一边于某个Contig重叠而另一边与另一个Contig重叠，这样将两个Contig联系起来，构成Scaffold。
因为宏基因组中混合了众多的微生物基因组，因此它的拼接是比较困难的，不确定哪些reads属于哪个物种， 因此拼接出来的是许多的小片段，一般保留大于300bp或500bp的序列来进行下一步的分析。
宏基因组拼接软件一般有MegaHIT、idba_ud、SOAPdenove和Spades，其中MegaHIT消耗的内存少，速度快， 它与idba_ud一样都可以设定好一个Kmer范围，再分别根据每个Kmer进行拼接，最后选择一个最优的拼接结果。Spades还合适与单细胞测序的拼接。
拼接完之后就要进行基因预测，一般采用MetaGeneMark对每个样品分别进行基因预测，接着将所有的基因 放在一起，利用CD_HIT去冗余，将相似的基因去除，最后构建一个非冗余的基因集，这个集合包含了所有 样品的所有基因。将各个样品的reads比对回这个基因集，可以计算出各个样品所含有的基因的相对丰度， 根据这个相对丰度可以进行差异分析、相似性分析等。
得到了预测的基因后，再将这些序列与现有的数据库比较来进行基因注释，比较常用的数据库有NCBI的NR库、 基因功能和代谢通路数据库KEGG、功能分类数据库COG和eggCOG，碳水化合物酶相关数据库CAZy和抗性基因数据库CARD等。 注释完基因之后可以进行富集分析，看各个样品之间差异的功能等。
ceshi