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populations_genomics

Proyecto GBS para Cocos nucifera

Pipeline para el anlásis bioinformático de datos prevenientes de RADseq: GBS (MslI) y ddRAD (PstI-MspI) en Cocos nucifera (con genoma de referencia)

Preprocesamiento steps (1y2) => procesamieto steps (3 al 7) => Analísis

Preprocesaiento : remover contaminaciones de otras librerias => demultiplexado => verificar sitio de restricción => remover adaptadores

Procesamiento: establecer las reglas para llamar SNPs y filtrar los SNPs de acuerdo a esas reglas

Analísis: utilizar los SNPs encontrados para responder preguntas biológicas

Software necesario

• ipyrad http://ipyrad.readthedocs.io/
  • Preprocesamiento, procesamiento
• stacks http://catchenlab.life.illinois.edu/stacks/
  • Preprocesamiento, procesamiento
• fastqc https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
  • Preprocesamiento
• PGDspider http://www.cmpg.unibe.ch/software/PGDSpider/
  • Procesamiento
• Bayescan http://cmpg.unibe.ch/software/BayeScan/
  • Analísis
• bowtie2 http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/
  • Preprocesamiento
• Custom scripts
  • Preprocesamiento, procesamiento, analísis *https://github.com/BiologiaComparativaCiB/POPULATIONS_GENOMICS/tree/master/MslI/scripts *https://github.com/BiologiaComparativaCiB/POPULATIONS_GENOMICS/tree/master/PstI-MspI/scripts

Funcionamiento de los scripts

se busca comparar la cantidad de SNPs recuperados a partir de los dos tratamientos enzimáticos MslI y PstI-MspI

• IPYRAD

• Preprocesamiento

• pre_procesamiento_1_MslI.sh y pre_procesamiento_1_PM.sh

  • revisa los índices combinatorios (XXXXXX+XXXXXX) de los archivos RAW y crea un índice por cada archivo (R1 Y R2) que contiene una lista con los diferentes indices combinatorios y su frecuencia.
  • luego el programa elige el índice combinatorio que más se repite (en este caso en el 98% de los reads) y elimina los reads con otros indices combinatorios, estos reads con estos índices son producto de contaminaciones de otras librerias en el proceso de secuenciación
  • luego el programa verifica que solo haya un tipo de índice combinatorio en el nuevo archivo RAW y crea un nuevo archivo en donde se puede verificar la existencia de un solo índice manualmente.
  • luego corre el fastqc para revisar anomalías en la información

• pre_procesamiento_2_reference_MslI.sh y pre_procesamiento_1_reference_PM.sh

  • crea los archivos de parámetros para cada uno de los analísis teniendo en cuenta sus particularidades de manera AUTOMÁTICA :)
  • corre los pasos 1 y 2 del ipyrad que corresponden a demultiplexado, verificación del sitio de la enzima de restricción y remoción de adaptadores.
  • debido a la particularidad de ser altamente degenerado que tiene el sitio de restricción de MslI (NNRTG) y al hecho de que ipyrad no recibe más de un nucleotido degenerado al mismo tiempo en la secuencia de restricción de la enzima (en este caso N y R) se descompone el dominio de la enzima de restriccion de manera que solo se use un nucleotido degenerado de la siguiente manera NNRTG = RRRTG, RCRTG, RTRTG, CRRTG, CCRTG, CTRTG, TRRTG, TCRTG, TTRTG se corre cada uno por separado y luego se unen de nuevo usando el parámetro -m en ipyrad

• Procesamiento

• wrapper_reference.sh y wrapper_2_reference.sh

  • en wrapper_reference.sh se unen los nueve analísis producto de los pasos 1 y 2 del ipyrad usando el parametro -m
  • se adiciona a los archivos de parametros de forma AUTOMÁTICA el PATH del genoma de referencia y el metodo de ensamblaje (denovo+reference en este caso)
  • se ramifica del análisis de forma AUTOMÁTICA de manera que se crea una rama estricta y una laxo en cuanto a las reglas para llamar SNPs a partir de los reads preprocesados, se varìan los parámetros 11, 12 ,14 , 23 del ipyrad
  • corre los pasos 3, 4, ,5 ,6 del ipyrad

• step_7_reference_MslI.sh y step_7_PM_reference.sh

  • paso de control para poder tener varios ensamblajes
  • se filtran los SNP's encontrados en los pasos anteriores de acuerdo al numero de veces que se repite el SNP en las 12 muestras, ensayamos con 1 repetición (2 individuos) , 2 repeticiones ,(4 individuos), 6 repeticiones (12 individuos, todos)
  • se ramifica el proceso de manera que se refleje la explicación anterior en el pipeline, se crean archivos de parametros con el sufijo min_sample_##

• STACKS

• Preprocesaiento

• pre_procesamiento_1_MslI.sh y pre_procesamiento_1_PM.sh (este paso es comùn a los analísis de stacks y ipyrad)

  • revisa los ìndices combinatorios (XXXXXX+XXXXXX) de los archivos RAW y crea un índice por cada archivo (R1 Y R2) que contiene una lista con los diferentes indices combinatorios y su frecuencia.
  • luego el programa elige el indice combinatorio que más se repite (en este caso en el 98% de los reads) y elimina los reads con otros indices combinatorios, estos reads con estos ìndices son producto de contaminaciones de otras librerias en el proceso de secuenciación
  • luego el programa verifica que solo haya un tipo de índice combinatorio en el nuevo archivo RAW y crea un nuevo archivo en donde se puede verificar la existencia de un solo índice manualmente.
  • luego corre el fastqc para revisar anomalìas en la información

• process_radtags.sh

  • stacks tiene la particularidad de no aceptar barcodes de diferente tamaño para la demultiplexacion de las muestras , entonces se corre el process_radtags tantas veces como grupos de barcodes haya
  • corre process_radtags tantas veces como grupos de barcodes haya
  • corre fasqc a los archivos resultantes para verificar anomalidades en los dato de forma manual

• Procesamiento

• refmap_MslI.sh y refmap_PM.sh

  • stacks no recibe los paired-end reads de la forma en que ipyrad lo hace por lo que hay que alinear los reads a un genoma de referencia y crear un único archivo .sam por cada muestra (en vez de dos)
  • refmap_MslI.sh debe ser corrido en primer lugar para que de forma automática haga los alineamientos muestra por muestra
  • se llama el script de stacks refmap.pl con todas las reglas para llamar los SNPs en los individuos y se ramfica en analísis entre los individuos de igual manera que en los scripts del pipeline ipyrad step_7_reference_MslI.sh y step_7_PM_reference.sh

• Analísis

• bayescan_input.sh

  • se busca saber cuales loci son neutrales y cuales están bajo selección. En primer lugar usando PGDspider se cambia el formato de los output de ipyrad de stacks de la siguiente manera .VCF => .PGD => .GESTE/Bayescan, de este modo se llevan los archivos al Bayescan que usa su propio formato, no se cambia directamente el formato VCF => GESTE/Bayescan porque se pierde información

• bayescan.sh

  • llama bayescan_2.1 y corre busca clasificar los loci según sean neutrales o están bajo selección según los parámetros establecidos en el script

• bayescan_graph.r

  • script R para graficar los resultados provenientes de bayescan.sh, crea una grafica en donde se marcan los loci bajo selección y establece el False Discovery Rate (FDR) un parámetro para poder para identificar los loci bajo selección

Arbol de directorios

https://github.com/BiologiaComparativaCiB/POPULATIONS_GENOMICS/blob/master/treefile.txt