单细胞与bulk转录组联合分析揭示了基于T细胞标记基因的肺腺癌分子亚型及其预后标志
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单细胞与bulk转录组联合分析揭示了基于T细胞标记基因的肺腺癌分子亚型及其预后标志 by 单细胞天地
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文章概述
基本信息
文章标题：Integrative analysis of single‑cell and bulk RNA‑sequencing data revealed T cell marker genes based molecular sub‑types and a prognostic signature in lung adenocarcinoma
发表时间：2024-01-10
发表杂志：Scientific Reports
影响因子：4.997
在线阅读链接： https://www.nature.com/articles/s41598-023-50787-w
文章摘要
背景：免疫疗法已成为治疗晚期或常规耐药恶性肿瘤的一种有前途的方法。在肺腺癌 （LUAD） 方面，T 细胞对抗肿瘤活性和肿瘤微环境有显著影响。然而，它们具体的贡献在很大程度上仍未得到探索。本研究旨在描述基于T细胞标志物基因的分子亚型和预后指标，从而揭示T细胞在LUAD预后和精准治疗中的重要性。
方法和结果：通过GEO数据库中的单细胞数据来鉴定细胞类型。随后，将来自单细胞测序分析的 T 细胞标记基因与来自 TCGA 数据库的差异表达基因整合，以精确定位 T 细胞相关基因。利用Cox分析，建立了分子亚型和预后特征，随后使用GEO数据集进行了验证。通过ESTIMATE、CIBERSORT和ssGSEA方法检查了两个亚型之间的分子学和免疫学以及治疗敏感性差异。还根据风险特征（risk signature）进行区室化、体细胞突变、诺模图、化疗敏感性预测和潜在药物预测分析。此外，实时荧光定量qPCR和HPA数据库证实了LUAD组织中特征基因的mRNA和蛋白质表达模式。
结论：这项研究产生了一种新型的基于 T 细胞标志物基因特征，在预后和预测 LUAD 患者的免疫治疗结果方面具有显著的潜力。
研究背景与实验设计
研究背景
肺癌一直是全球最常见的癌症，占全球所有癌症死亡人数的20%以上。肺腺癌 （LUAD） 是主要的组织学亚型，占肺癌总发病率的近 45%。尽管 LUAD 的治疗方法和个性化治疗取得了进展和利用，但与这种恶性肿瘤相关的 5 年总生存率仍低于 25%。
最近采用的针对免疫检查点的免疫疗法显着提高了临床益处，并随后改变了LUAD的治疗格局。但是只有少数 LUAD 患者可以从免疫检查点抑制剂 （ICI） 治疗中受益。因此，发现合适的生物标志物并建立相关的预测模型以有效估计LUAD的预后和治疗结果至关重要。
肿瘤微环境 （TME） 是一个复杂的生物系统，具有高度复杂和动态的特点。TME显著影响T细胞的活性、功能和作用，在抗肿瘤免疫反应中起着举足轻重的作用。T细胞的存在和活化状态具有作为NSCLC（非小细胞肺癌）预后指标的潜力。然而，NSCLC 中的 CD8+ T 细胞分化轨迹可能会阻碍 CD8+ T 细胞对免疫检查点治疗的敏感性。了解T细胞免疫因子的潜在机制对于克服LUAD治疗中的耐药性至关重要。考虑到与T细胞有关的LUAD抗肿瘤免疫作用的研究稀缺，检查基因表达模式及其与预后和治疗结果的关联至关重要。
单细胞测序是一种高通量技术能够研究细胞异质性和细胞间相互作用，很多研究正在通过分析肿瘤细胞和免疫细胞相互作用来预测患者对免疫治疗的反应来个性化治疗。所以该研究对从LUAD样本中获得的scRNA-seq和bulk RNA-seq数据进行全面评估，旨在辨别T细胞标记基因并建立预后特征，并通过GEO队列进一步验证该特征的预测能力。
样本
单细胞RNA测序数据
GSE148071（42个患者）TCGA中LUAD患者的表达信息和临床数据
共有504个患者和54个健康肺组织样本验证数据集
GSE13213（117个患者的转录组学和临床记录）
研究结果
鉴定 T 细胞标志物基因表达谱
利用GSE148071的42个样本的单细胞表达矩阵，作者得到了 17 个不同的细胞簇——包括癌细胞、髓系细胞、B 细胞、纤毛细胞、肺泡细胞、基底细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、内皮细胞、T 细胞、分泌细胞、肥大细胞、神经内分泌细胞、基底细胞、离子细胞和上皮细胞——每个细胞簇都由其特征标记基因识别（图 1B）。此外，作者观察到各种LUAD患者标本中T细胞分布的明显差异（图1C），由此鉴定出LUAD相关的T细胞标记基因。“CellChat“ 方法的应用揭示了不同细胞类型之间的连接（图1E）。最终构建了包含三种免疫细胞（肥大细胞、B 细胞和 T 细胞）和癌细胞的信号通路图（图 1D）。
差异性T细胞标志物基因鉴定及生物学功能富集分析
通过对单细胞样本的检查，作者获得了578个T细胞标记基因。根据 TCGA 数据库中肿瘤和健康肺组织的比较结果，作者鉴定了 9645 个 DEG。这些基因的交集（54个基因）被认为是差异性T细胞标记基因，并用于随后的下游分析（图2A）。根据GO分析，生物过程主要富集于免疫系统过程、细胞对化学刺激的反应和免疫系统发育（图2B）。细胞成分主要集中在细胞外区域、转录因子复合物和染色质中（图 2C）。在分子功能类别中，差异 T 细胞标记基因主要与相同的蛋白质结合、信号受体结合和 DNA 结合转录激活因子活性、RNA 聚合酶 II 特异性相关（图 2D）。KEGG分析结果表明这些基因与癌症、人类T细胞白血病病毒1感染、细胞凋亡途径和IL-17信号通路显著相关（图2E）。综上所述，上述发现表明重叠集中的基因与免疫相关功能密切相关。
分子亚型的鉴定以及亚型与肿瘤免疫环境和致瘤等级的相关性分析
通过单因素Cox分析，文中确定了七个预后相关基因，其中PTTG1、TUBA4A和DDIT4为保护因素，BTG2、IL7R、GIMAP7和SLA为危险因素（图3A）。采用这七个预后相关基因进行 molucelar 亚型分析，从而将 LUAD 患者聚类为两个亚组，其特征具有良好的内部一致性和恒定性（图 3B-D）。此外，簇 1 比簇 2 显示出更良好的预后（图 3E）。热图显示，两个簇的基因表达存在差异，与临床病理因素（如分期、N分期和T分期）有很强的联系，但在性别、年龄和M分期方面没有观察到显著差异（图3F）。CIBERSORT算法显示浸润免疫细胞存在显著差异；T 细胞 CD4 记忆静息在簇 2 中显着降低，而 T 细胞 CD4 记忆激活和 T 细胞调节 （Tregs） 在簇 2 中显著增加（图 3G）。
此外，簇 2 的血管生成活性和致瘤细胞因子明显更高（图 3H），并且簇 1 与许多 MHC 分子的表达升高有关（图 3I）。由于不同亚型之间的免疫细胞浸润情况存在显着差异，作者评估了LUAD治疗中与主要免疫检查点的相关性。簇 2 表现出 EGFR 和 PD-L1 的表达增强，而 ROS1 和 RET 的表达降低（图 3J）。
T细胞标志物特征的构建和验证
为了提高候选基因的特异性，文中进行了多变量Cox回归分析，并为模型选择了五个基因（图4A）。显示我们特征（signature）的单个基因的系数（图 4B）。计算出的风险评分与 SLA、DDIT4、TUBA4A、PTTG1 和 BTG2 之间的关系如图 4C 所示。与风险评分较低的患者相比，评分较高的患者预后较差，特征的 AUC 评分在 1 年时为 0.684，在 3 年时为 0.654，在 5 年时为 0.639（图 4D）。然后，作者利用GSE13213数据集来验证特征的可靠性和普遍适用性，结果表明在生存分析和ROC方面具有很有前途的能力（图4E）。
此外，图4F，G显示该特征也被确定为独立的风险因素。文中还根据各种临床病理学信息检查了风险评分之间的亚组差异，研究结果显示，T3-4、N2-3 和 III-IV 期分类的患者表现出更高的风险评分，这表明更高的风险评分与更晚期的肿瘤相关（图 4H-J）。如图 4K 所示，作者结合患者年龄和风险评级，使用多变量 Cox 回归分析的结果创建列线图，用于估计 LUAD 的 1 年、3 年和 5 年生存前景。校准图表显示，在1年、3年和5年间隔内，实际生存时间和预期生存时间之间具有高度一致性（图4L）。
肿瘤免疫细胞浸润和免疫检查点抑制剂的评价
以前的研究已经强调了微环境在癌症发展中的至关重要性。因此，作者对上述特征与肿瘤免疫微环境之间的关联进行了彻底的检查。通过使用 ssGSEA 算法，作者发现与低风险队列相比，高风险队列的免疫细胞浸润减少，免疫相关通路的存在减少（图 5A、B）。此外，ESTIMATE 算法显示，与低风险队列相比，高风险队列的 ESTIMATE 评分、免疫评分、基质评分和肿瘤纯度评分均有所降低（图 5C）。
在免疫细胞浸润的分析中，作者重点关注CD8 + T细胞，与低风险队列相比，高风险队列中观察到CD8 + T细胞的浸润水平更高。此外，在巨噬细胞 M0 和 M1 中观察到相同的浸润模式（图 5D）。高危人群的MHC分子表达水平明显降低，如图5E所示。最后，作者检测了LUAD治疗中常见免疫治疗靶点的表达模式，发现高危和低危人群之间存在显著差异（图5F）。
血管生成活性、间充质 EMT、致瘤细胞因子、干性评分和 TSI 的关联
在之前的分子亚型分析中，作者确定了不同簇和特定生物学特征之间的关联，包括血管生成活性、间充质 EMT、致瘤细胞因子和干性评分。为了进一步研究这种关系，作者计算了LUAD患者的这些评分，并在高风险和低风险队列之间进行了比较。图6A表明，高危人群的血管生成活性增加，然而，在间充质EMT、致瘤细胞因子和干性评分的表达方面没有观察到统计学上的显著差异。在图6B中，绘制了风险评分与四个指标的关联，揭示了风险评分与血管生成活动评分（R = 0.41，p < 9.43e−07）、间充质EMT评分（R = − 0.096，p = 0.035）、干性评分（R = − 0.065，p = 0.15）和致瘤细胞因子评分（R = − 0.041，p = 0.37）之间存在正相关关系。
此外，作者还探讨了风险评分与TSI之间的关联，对风险评分与 TSI 之间关联的调查显示，高风险组表现出比低风险组更高水平的 DMPsi、mRNAsi、EHNsi、EREG-mDNAsi、mDNAsi 和 EREG-mRNAsi。然而，只有DMPsi和mRNAsi表现出显著差异（P < 0.05），如图6C所示。
根据特征进行基因突变和TMB分析
图7A，B分别显示了LUAD在高风险和低风险队列中的总体突变谱。TP53、TTN、MUC16、CSMD3 和 RYR2 是风险人群中突变频率最高的基因，在高风险人群（图7C）中表现出更高的突变（图 7C、D）。根据高风险队列，作者观察到大多数基因之间的基因突变共现，表明多个相关基因突变可能共存，为肿瘤样本遗传变化和癌症发展机制提供了见解。
此外，在高风险队列中发现了相互排斥的 KRAS-TP53 突变，这表明这些基因突变不太可能在同一样本中同时发生（图 7E）。图7F显示，低风险队列也表现出基因突变的相互排斥性和共生性。这些发现为探索LUAD靶向治疗中的基因突变机制提供了有价值的信息。根据图7G，作者比较了两个队列之间的肿瘤突变负荷（TMB）水平，发现与低风险队列相比，高风险队列中的TMB明显更高。Kaplan-Meier曲线显示，高TMB队列的预后优于低TMB队列（P = 0.021）（图7H）。在整合前一个风险特征后，低风险+高TMB队列比其他三个队列显示出明显的预后（P<0.001）（图7I）。最后，作者评估了五个特征基因的突变模式，发现 SLA 和 BTG2 的突变率明显高于 DDIT4、TUBA4A 和 PTTG1（如图 7J所示）。
化疗敏感性分析的预测
文中进一步采用“pRRophetic”来研究低风险和高风险队列之间化疗药物IC50表达的差异（图8A）。研究结果显示，高风险人群中的LUAD表现出抗癌药物的IC50值降低，如AICAR, AKT.inhibitor.VIII, bleomycin, bortezomib, bosutinib, cisplatin, dasatinib, docetaxel, doxorubicin, erlotinib, etoposide, gefitinib, gemcitabine, imatinib, paclitaxel, sorafenib, sunitinib, and vinorelbine。低风险患者对抗癌药物（如 axitinib 和 temsirolimus）的IC50值较低。
作者使用 PubChem 数据库展示了四种最流行的化疗药物—— vinorelbine, temsirolimus, paclitaxel, and imatinib 的 2D 结构（图 8B）。结果表明，本研究中确定的风险模型可能具有临床效用，可作为 LUAD 患者抗癌药物选择的预测因子。
验证 LUAD 中的 mRNA 和蛋白质表达
采用RT-qPCR法进一步阐明了5个候选基因在正常组织和LUAD组织中的表达模式。作者收集了 10 对 LUAD 肿瘤样本及其相应的邻近正常组织。与正常肺组织相比，LUAD组织中DDIT4、TUBA4A和PTTG1的表达水平升高，而LUAD组织中SLA和BTG2的表达水平降低。该结果与这5个基因在TCGA中的表达一致。此外，利用人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库研究了LUAD肿瘤组织和正常组织中SLA、BTG2、DDIT4、TUBA4A和PTTG1的蛋白表达水平。与正常组织相比，肿瘤组织中 DDIT4、TUBA4A 和 PTTG1 的蛋白水平显着升高，而 SLA 和 BTG2 显着降低。
小结
总结一下，文献大致分为4个部分：
首先作者将来自单细胞测序分析的 T 细胞标记基因与来自 TCGA 数据库的差异表达基因整合取交集，得到 T 细胞相关基因。（54个基因） 然后利用Cox分析，建立了分子亚型和预后特征，随后使用GEO数据集进行了验证。通过ESTIMATE、CIBERSORT和ssGSEA方法检查了两个亚型之间的分子学和免疫学以及治疗敏感性差异。（5个基因） 根据风险特征（risk signature）进行区室化、体细胞突变、诺模图、化疗敏感性预测和潜在药物预测分析。（5个基因） 实验验证：实时荧光定量qPCR和HPA数据库证实了LUAD组织中特征基因（5个基因）的mRNA和蛋白质表达模式。
揭示胶质母细胞瘤中T细胞功能障碍的免疫调节机制：髓系细胞与IL-10的关键作用
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